DNA 序列轉化為完全正確折疊的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的過(guò)程極為復雜，涉及轉錄、翻譯、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊和最終分泌等數個(gè)步驟，其中任何一個(gè)步驟出現問(wèn)題均能影響蛋白質(zhì)的表達[1]，進(jìn)而導致蛋白降解、聚集及引起細胞毒性等 [1]。
通常，對于候選治療性蛋白藥物，尤其是單、雙抗藥物的設計改造目的主要為增加其對靶點(diǎn)蛋白的親和力或改善其熱穩定性，很少評估它們在宿主細胞系，例如 CHO 細胞中的表達難易程度[2]。而生物藥物候選分子在開(kāi)發(fā)早期的低表達量是導致產(chǎn)品早期開(kāi)發(fā)終止的主要原因之一。
難表達治療性蛋白通常是那些轉錄、翻譯和折疊/組裝反應速率不匹配的蛋白藥物，包括類(lèi)毒素、酶、膜蛋白、部分單、雙抗、以及疏水性較強的蛋白質(zhì)[3,4]。協(xié)調優(yōu)化各種相互關(guān)聯(lián)的動(dòng)態(tài)過(guò)程（從基因序列到分泌蛋白）是優(yōu)化產(chǎn)物收率的必要條件[3]。
漢騰解決方案
為解決這一難題，漢騰生物針對難表達蛋白藥物開(kāi)發(fā)了 DTEasy 工具箱，可集成并優(yōu)化難表達蛋白表達過(guò)程中的各個(gè)關(guān)鍵階段，成功提高蛋白產(chǎn)量，以助力蛋白藥物分子順利實(shí)現產(chǎn)業(yè)化。
01 分子改良策略
? 基于氨基酸序列分析和蛋白結構預測，通過(guò)引入點(diǎn)突變、優(yōu)化氨基酸序列；
? 進(jìn)行蛋白截短、融合表達標簽蛋白；
? 篩選適合的 抗體藥物VH/VL 框架對，基因工程優(yōu)化重、輕鏈序列等；以改善蛋白的三維結構，提高蛋白熱穩定性。
02 宿主選擇策略
相較其它表達系統宿主，哺乳動(dòng)物細胞具有更優(yōu)異的蛋白質(zhì)折疊和二硫鍵形成能力[5]。不同種類(lèi)哺乳動(dòng)物細胞的糖基化能力也有所不同，對于表達糖基化修飾要求較高的蛋白，如凝血因子等，可選用漢騰獨家開(kāi)發(fā)的GlycoExpress® （GEX）細胞系。
此外，表達一些組織特異性較高的蛋白，如G蛋白受體 （GPCR）胞外結構域， 相較于傳統的CHO細胞系， 該蛋白在GEX® 細胞中的表達量可提升十倍。
03 載體優(yōu)化策略
通過(guò)轉錄組差異表達分析，將與難表達蛋白產(chǎn)量正相關(guān)的順式作用元件插入到表達載體中，選擇多拷貝載體及難表達蛋白專(zhuān)用載體，或共表達蛋白抑制劑、配體等。
04 工藝構建
在細胞培養過(guò)程中可添加專(zhuān)用添加劑，針對不同的細胞制定對應的篩選以及培養工藝，以提高活細胞密度并有助于延長(cháng)培養時(shí)間，最終達到提升產(chǎn)量的目的。DTEasy 專(zhuān)有添加劑可只需在培養過(guò)程中簡(jiǎn)單的單次添加，即可最高提升 3 倍表達量。漢騰生物建立的 CBoost® 加強型工藝平臺，加強型補料批培養可達到超過(guò)兩倍的蛋白表達量。此外，由于細胞需要平衡蛋白表達和生長(cháng)，外源蛋白表達會(huì )給細胞造成較大壓力[6]。針對這一特點(diǎn)，漢騰生物采用了更為溫和的環(huán)軌搖晃式反應器，操作簡(jiǎn)便的同時(shí)，還可以縮短混合時(shí)間、降低剪切應力、減少泡沫及污染。
案例一
信號肽位于分泌蛋白的 N 端，引導新合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入內質(zhì)網(wǎng)腔．而信號肽序列則在信號肽酶的作用下被切除。信號肽篩選是增強蛋白分泌的一種重要途徑。選擇不同的信號肽會(huì )導致不同的融合蛋白 N 端截短比例，進(jìn)而可能對融合蛋白的純度和活性產(chǎn)生影響。
針對重組胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）項目，漢騰生物設計了多種信號肽用于增強 GLP-1 蛋白或 GLP-1 融合蛋白在宿主細胞中的表達（結果如下，詳細內容參考漢騰專(zhuān)利：信號肽在表達GLP-1融合蛋白中的應用,CN114539357B）。通過(guò)不同信號肽的組合，藥物蛋白的純度和生物學(xué)活性得以顯著(zhù)提升（表 1）。
表1. 細胞培養上清中 GLP-1-Fc 融合蛋白的表達量以及純化后融合蛋白純度
案例二
對于某些過(guò)量表達后會(huì )引起細胞毒性的蛋白質(zhì)，如蛋白酶和凝血酶，可以考慮共表達其抑制劑，減少其表達給細胞存活造成的壓力，從而提高蛋白產(chǎn)量。
針對組織型纖溶酶源激活劑（tissue plasminogen activator，t-PA），漢騰生物構建了共表達 t?PA 和 t?PA 抑制劑的雙表達框載體以及一步層析純化工藝（結果如下，詳細內容參考漢騰專(zhuān)利：t-PA純化方法，CN14426962B）。其中 t?PA 與 t?PA 抑制劑形成的非共價(jià)復合物結構松散，易于分離。此外，目前 t?PA 的純化工藝一般需要 3～4 步才能實(shí)現 90％以上的純度，共表達 t?PA 抑制劑后結合使用賴(lài)氨酸親和層析，能夠實(shí)現 t?PA 的一步層析純化（圖 1）。最終 tPA 的純化后產(chǎn)率達 361.5 mg/L，是現有技術(shù)的 3 倍以上。
圖 1. 賴(lài)氨酸親和層析結果
案例三
商業(yè)生產(chǎn)中使用細胞培養生產(chǎn)充足蛋白質(zhì)的方法主要分為三種：分批培養、補料分批培養和連續培養。分批培養方法中，所有營(yíng)養物質(zhì)都在初始基培養基中提供，隨著(zhù)培養時(shí)間延長(cháng)，營(yíng)養物質(zhì)不斷減少，乳酸等代謝抑制物增加。補料分批培養是指在培養過(guò)程中，間歇或連續地補加新鮮培養基，可以避免細胞和代謝過(guò)程中的產(chǎn)物以及某些營(yíng)養物質(zhì)的缺乏對細胞的抑制作用。連續培養是培養過(guò)程中不斷灌注培養基能同時(shí)清除廢物、提供營(yíng)養和收獲產(chǎn)品的培養方法。針對不同的難表達蛋白選擇更合適的細胞培養方式以及額外補充專(zhuān)用添加劑，有助于提升蛋白產(chǎn)量。
此前，并無(wú)高效表達人類(lèi)神經(jīng)生長(cháng)因子（human never growth factor，hNGF）的培養方法，極大限制了 hNGF 的大規模生產(chǎn)和在臨床與藥物方面的應用。漢騰生物采用補料分批培養方法，并發(fā)現了新的添加劑，可以將 hNGF 重組蛋白的表達量提高至少 100%，產(chǎn)量最高可提升至 2900 mg/L左右（圖 2），較大地提升了 hNGF 在 CHO 細胞中的表達水平（詳細內容參考漢騰專(zhuān)利：重組神經(jīng)生長(cháng)因子的高效表達方法，CN2023108028220）。
圖 2. 含有不同濃度添加劑的培養基條件下 β-NGF 蛋白表達量的柱形圖
案例四
攪拌式生物反應器是細胞培養領(lǐng)域常用的反應器，由于其攪拌槳易造成剪切力，且其深層通氣方式易產(chǎn)生泡沫從而造成更巨大的剪接力，會(huì )對細胞造成傷害，甚至死亡。此外，攪拌式生物反應器在擴大培養過(guò)程中，由于涉及的參數較多，流體力學(xué)復雜，造成放大困難，甚至失敗。
環(huán)軌搖晃式生物反應器是一種通過(guò)環(huán)軌搖晃混合方式進(jìn)行細胞培養的生物反應器，可以很好地解決攪拌式生物反應器存在的問(wèn)題。但由于工作原理存在較大差異，攪拌式生物反應器的培養條件并不適用環(huán)軌搖晃式生物反應器。為解決這一問(wèn)題，漢騰生物成功開(kāi)發(fā)了一種細胞培養的方法（詳細內容參考一種使用環(huán)軌搖晃式生物反應器培養細胞的方法，CN113862224A）。該方法采用梯度增速及降溫的方式培養細胞，同時(shí)對培養基進(jìn)行適當優(yōu)化，細胞活率以及蛋白表達量更高（圖 3-4）。
圖 3. 活細胞密度（VCD）和細胞活率（VIA）。SB-10：環(huán)軌搖晃式生物反應器；AK02：3 L攪拌式生物反應器；AK15：15 L攪拌式生物反應器
圖 4. 蛋白表達量。SB-10：環(huán)軌搖晃式生物反應器；AK02：3 L攪拌式生物反應器；AK15：15 L攪拌式生物反應器
綜上，漢騰DTEasy平臺通過(guò)先進(jìn)的分子設計、載體優(yōu)化、宿主細胞系的精細篩選以及定制化工藝，成功解決了多種類(lèi)型蛋白質(zhì)的難表達問(wèn)題，我們期待為您提供定制化服務(wù)！
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漢騰專(zhuān)利（本文相關(guān)）
1. 信號肽在表達GLP-1融合蛋白中的應用[P].廣東省:CN202011358998.4,2024-07-30.
2.t-PA純化方法[P].廣東省:CN202111574380.6,2024-06-18.
3.重組神經(jīng)生長(cháng)因子的高效表達方法[P].廣東省:CN202310802822.0,2023-11-10.
4.一種使用環(huán)軌搖晃式生物反應器培養細胞的方法[P].廣東省:CN202010618579.3,2021-12-31.
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